PCR primers
3’ATCCGGTTAATTCGGTATATCGCGTAGCGCTCTAGCGTAGCTGA 5’
5’TAGGCCAATTAAGCCATATAGCGCATCGCGAGATCGCATCGACT 3’
Je wil het dikgedrukte stukje DNA met PCR kopiëren. Welke primers gebruik je dan?
Leerdoelen
•Je kunt uitleggen op welke manier de basenvolgorde in het DNA kan worden bepaald.
•Je kunt uitleggen wat PCR is en hoe PCR werkt.
De PCR-techniek: DNA kopiëren
Wat heb je nodig?
Om te starten met de polymerase chain reaction (PCR), hebben we een paar belangrijke ingrediënten nodig:
•DNA-polymerase-enzym, dat de kopieertaken op zich neemt.
•Nucleotiden, dit zijn de bouwstenen van DNA.
•Korte DNA-primers van 20 tot 30 nucleotiden zijn essentieel. Deze primers zijn complementair aan het stukje DNA dat we willen repliceren.
•Twee verschillende primers, want de bovenste en onderste streng worden vanaf andere kanten gelezen.
Hoe werkt het?
1.Denaturatie: Om te beginnen verwarmen we het DNA tot 95 graden Celsius. Hierdoor raken de twee DNA-strengen los van elkaar.
2.Annealing: De temperatuur wordt verlaagd tot 65 graden, zodat de primers zich kunnen hechten aan de losse DNA-strengen.
3.Extensie: Bij 72 graden gaat het DNA-polymerase aan de slag om vanaf de primers nieuwe DNA-strengen te bouwen. Het DNA-polymerase leest de oorspronkelijke streng van 3' naar 5' en bouwt de nieuwe streng van 5' naar 3'
Deze cyclus van verwarmen en afkoelen wordt herhaald, waardoor het specifieke DNA-segment exponentieel wordt vermenigvuldigd.
Waarom bacterieel DNA-polymerase?
Bij de PCR-techniek is een speciale rol weggelegd voor DNA-polymerase afkomstig uit bacteriën die in hete bronnen leven. Dit enzym kan goed overweg met de hoge temperaturen die nodig zijn voor PCR, in tegenstelling tot veel andere enzymen die bij deze temperaturen zouden denatureren.
Van DNA kopiëren naar DNA sequencen
Het bepalen van een DNA-volgorde
Nu we weten hoe we DNA kunnen kopiëren, is de volgende stap het bepalen van de nucleotidevolgorde van de leidende streng. Hiervoor gebruiken we een aangepaste versie van PCR, waarbij deels 'kreupele' nucleotiden ingezet worden die een signaal afgeven, omdat ze gelabeld zijn met een fluorescerende stof. Deze kunnen zich niet verder verbinden, omdat ze geen -OH-groep hebben om verder te bouwen, wat leidt tot DNA-strengen van verschillende lengtes die allemaal eindigen op zo'n kreupele nucleotide.
Gelelektroforese: DNA op grootte scheiden
Via gelelektroforese scheiden we de DNA-strengen op basis van hun lengte. Het DNA wordt ingeladen op het negatieve front, aangezien DNA negatief geladen is, zal het willen verplaatsen naar het positieve front. Kleinere fragmenten bewegen sneller door de gel dan grotere. Door dit proces kunnen we zien op welke positie de kreupele nucleotiden zijn ingebouwd en dus op welke posities welke nucleotiden zitten. Aangezien zeker is dat de laatste nucleotiden de kreupele zijn, kun je de volgorde van het DNA bepalen.
Van individuele letters naar het hele verhaal
Door dit proces per nucleotidesoort ('A', ‘G', ‘C’ en ‘T’) te herhalen en de resultaten naast elkaar te leggen, kun je in principe van links naar rechts de nucleotidevolgorde van een streng lezen. Het resultaat? Een nauwkeurig afgelezen segment van DNA!
