Leerdoelen
•Je kunt uitleggen wat kolomchromatografie is en welke onderdelen hierbij gebruikt worden.
•Je kunt de werking van de mobiele fase en stationaire fase beschrijven.
•Je kunt benoemen wat het verschil is tussen een polaire en apolaire kolom.
•Je kunt een chromatogram interpreteren en hierin retentietijd en piekoppervlak herkennen.
•Je kunt een kwalitatieve analyse uitvoeren door retentietijden te vergelijken.
•Je kunt een kwantitatieve analyse uitvoeren door piekoppervlaktes te gebruiken om concentraties te bepalen.
Kolomchromatografie
Kolomchromatografie is een techniek waarmee een mengsel van stoffen gescheiden kan worden op basis van de verschillende affiniteiten (voorkeuren) die elke component in het mengsel heeft voor een stationaire en mobiele fase.
Onderdelen van kolomchromatografie
•Kolom: Dit is een dunne buis gevuld met een stationaire fase die vastzit aan de wand van de buis
•Mobiele Fase: Dit kan een gas of een vloeistof zijn. Deze stroomt door de kolom en draagt het monster (het te analyseren mengsel) vanaf het injectiepunt.
•Scheiding: De stoffen in het monster worden gescheiden omdat sommige componenten meer affiniteit hebben voor de stationaire fase, terwijl anderen een voorkeur hebben voor de mobiele fase.
•Detector: Aan het einde van de kolom wordt een detector gebruikt om de verschillende stoffen te detecteren op basis van hun retentietijd (de tijd dat ze in de kolom hebben doorgebracht).
Er zijn twee hoofdtypen kolomchromatografie:
1.Gaschromatografie (GC): Als de mobiele fase een gas is.
2.Vloeistofchromatografie (LC): Als de mobiele fase een vloeistof is.
Polaire of apolaire kolommen
De keuze van de stationaire fase (de coating aan de binnenkant van de kolom) is cruciaal omdat deze de affiniteit van de stoffen in het monster bepaalt. Er zijn twee hoofdtypen:
1.Apolaire kolom → heeft een voorkeur voor apolaire moleculen. Bijvoorbeeld, in een apolaire kolom zal hexaan, dat apolaire CH-bindingen heeft, een grotere retentietijd hebben dan ethanol, dat ook een polair molecuul is.
2.Polaire kolom → heeft een voorkeur voor polaire moleculen. Met behulp van hetzelfde voorbeeld zal ethanol, dat waterstofbruggen kan vormen, een grotere retentietijd hebben dan hexaan in een polaire kolom.
Chromatogram
Het resultaat van kolomchromatografie wordt grafisch weergegeven in een chromatogram.
•De x-as toont de retentietijd (
•De y-as toont het detectorsignaal.
•Een stof met sterke interactie met de stationaire fase blijft langer in de kolom en produceert een piek bij een grotere retentietijd.
Kwalitatieve analyse
Bij een kwalitatieve analyse wordt vastgesteld welke stof aanwezig is.
•Door de retentietijd van een piek te vergelijken met bekende referentiewaarden kan worden bepaald welke stof correspondeert met de gemeten piek.
•Een stof met een grotere retentietijd heeft een grotere affiniteit voor de stationaire fase.
Kwantitatieve analyse
Bij een kwantitatieve analyse wordt de concentratie van een stof bepaald aan de hand van het chromatogram.
•De piekoppervlakte is recht evenredig met de concentratie van de betreffende stof.
•Door een bekende concentratie te vergelijken met een onbekende concentratie kan de onbekende waarde worden berekend.
Voorbeeld:
Voorbeeld
Een oplossing met een bekende concentratie phenacetine van
geeft een piekoppervlak van:
In het chromatogram van het onbekende monster verschijnt bij een retentietijd van 18 minuten een piek met een piekoppervlak van:
De verhouding tussen de piekoppervlakten wordt gebruikt om de concentratie van het onbekende monster te bepalen. Hierbij geldt dat de piekoppervlakte recht evenredig is met de concentratie: een kleinere piekoppervlakte betekent een lagere concentratie. Door de piekoppervlakte van het onbekende monster te vergelijken met die van de bekende oplossing kan de concentratie van het onbekende monster worden berekend.
Dopingcontrole
Een toepassing hiervan is dopingcontrole. In urine van atleten wordt gezocht naar metabolieten van verboden stoffen, zoals stanozolol N-glucuronide. Via kolomchromatografie wordt bepaald of er een piek verschijnt met dezelfde retentietijd als deze metaboliet. Als dat het geval is, wijst dit op dopinggebruik. Voor extra zekerheid wordt de stof vervolgens geanalyseerd met massaspectrometrie om de identiteit definitief te bevestigen.
