De volgende stap was het stimuleren van de autotrofe levenswijze van E. coli. Dit kan worden bereikt door ervoor te zorgen dat E. coli geen glucose meer kan gebruiken voor de productie van ATP. De biologen schakelden daartoe drie genen uit die coderen voor enzymen die betrokken zijn bij de glycolyse. Vervolgens werd deze gemodificeerde E. coli gekweekt in een bioreactor (afbeelding 2) waaraan continu een voedingsmedium werd toegevoegd. Dit bevatte onder andere methaanzuur en de monosacharide xylose.
Xylose was nodig om ervoor te zorgen dat de bacteriën niet meteen zouden sterven aan energiegebrek. E. coli kan xylose namelijk omzetten in pyrodruivenzuur zonder daarbij gebruik te maken van de glycolyse.
Tijdens de kweekperiode werd de hoeveelheid xylose in het voedingsmedium geleidelijk afgebouwd naar nul.
Vanaf de bodem van de reactor werd lucht met CO2 toegevoegd.
[!!! FAULTY IMAGE: alt={},max width=\textwidth]
De E. coli-bacteriën waarmee werd gestart, hadden nog veel stofwisselingsprocessen die passen bij een heterotrofe levenswijze. Na 300 dagen waren de bacteriën in de bioreactor echter volledig autotroof.
